Вакуом

В начале XX столетия французские цитологи предложили название «вакуом» для обозначения сложной системы вакуолей и гранул, обнаруженной в растительных и животных клетках. По их мнению, вакуом состоял из множества цитоплазматических структур, в том числе аппарата Гольджи, за исключением митохондрий, которые они рассматривали как отдельную систему, хондриом. Такое разделение оказалось настоящим предвидением, и слово «вакуом», которое ранее не находило всеобщего признания, заслуживает быть воскрешенным. Термин «вакуолярная система», который иногда используется в таком же значении сегодня, более расплывчатый, поскольку им длительное время обозначали только импортную часть всей системы.Импорт и экспорт, каждый с соответствующими реакциями процессинга в них, — основные функции вакуома. Если, однако, рассматривать анатомическую и функциональную организацию системы, то наиболее .поразительной чертой окажется ее разделение на два домена аппаратом Гольджи.
Эндоплазматический ретикулум (ЭР), или эндоплазматический домен, располагается по одну сторону от Гольджицис- сторону, которую мы называем эндоплазматической. Связанный с производством белков, ЭР имеет отчетливо выраженную полярность от участков, связывающих рибосомы, в шероховатом ЭР к переходным элементам между гладким ЭР и Гольджи. За исключением этой асимметрии, мембраны ЭР, которые также являются местом «обитания» некоторых метаболических систем, не связанных с секрецией (см. гл. 13), во многом однородны по составу. Продвижение по этой части вакуома осуществляется весьма просто и в одном направлении. ЭР направляет свое содержимое в Гольджи со слегка заметным обратным током. Согласно имеющимся данным, секреторные продукты перемещаются через эффективную одностороннюю «замок — ловушку», даже если их транспорт может зависеть от двустороннего направленного мембранного челнока. Это означает также, что импортный поток останавливается у барьера Голь-джи. Действительно, материалы, захваченные эндоцитозом, не попадают в эндоплазматический домен. Нам удалось сделать это, но только прокладывая путь через «ловушку».
Совсем иная картина наблюдается по другую сторону от аппарата Гольджи, где располагается то, что можно назвать экзоплазматическим доменом вакуома (не общепринятое, но весьма полезное название, которое мы распространяем на транс-поверхность аппарата Гольджи). Этот домен включает множество везикул, вакуолей и гранул всевозможной формы и величины, связанных с аппаратом Гольджи, друг с другом и с околоклеточным пространством сложной сетью транспортных путей. Мембраны, окружающие эти структуры, имеют некоторые общие свойства с плазматическими мембранами. Они толще мембран ЭР (около 10 нм против 7 нм) в значительной степени из-за большей плотности олигосахаридных боковых цепочек, расположенных на внутренней поверхности. Они также содержат преобладающее количество некоторых фосфолипидов, таких, как сфингомиелин, и высокие концентрации холестерина. Однако их белковый состав далеко не однороден, даже плазматическая мембрана разделена на отдельные области.
Передвижение в этой части вакуома чрезвычайно затруднено и осуществляется в разных направлениях. Из Гольджи основной поток секреторных продуктов направляется к сайтам (местам) их выгрузки, расположенным на клеточной поверхности, либо непрерывно посредством цепочки мелких везикул, либо прерывисто, с промежуточной остановкой в секреторных гранулах после концентрации в конденсирующих вакуолях. По одному из важных путей кислые гидролазы доставляются из Гольджи в лизосомы. Кроме того, перегрузка секреторного пути ведет к открытию кринофагического обходного пути, который направляет избыточные продукты из секреторных гранул в лизосомы.
Фагоцитоз, опосредованный рецепторами эндоцитоз и, возможно, другие формы эндоцитоза составляют импортные пути. Они сходятся в основном в лизосомах, но по пути могут, особенно проходя через эндосомы, образовывать ответвления — пути, которые обходят лизосомы и по которым поглощенные материалы Доставляются к тому месту, где они проникли в клетку (так называемая регургитация), или переносятся через клетку к определенному внеклеточному району (диацитоз), или доставляются в гранулы хранения.
Эта сеть транспортных путей, по-видимому, значительно усложнится, если одновременно рассматривать движение как содержимого, так и контейнеров, в которых оно перемещается. Еще до недавнего времени величину перемещения контейнеров недооценивали. Обычно считалось, что мембранный материал, включенный в плазматическую мембрану при экзоцитозе, возвращается при эндоцитозе, присоединяется к лизосомальным мембранам при слиянии эндосом с лизосомами, поглощается при аутофагической сегрегации и в конце концов разрушается при переваривании в лизосомах. Как полагали, в целях компенсации новая мембрана создается в эндоплазматическом ретикулуме и передается в Гольджи для замещения материала, израсходованного плазматической мембраной, при экзоцитозе. Согласно этой концепции, известной как теория «мембранного потока» и включающей динамическую модель функционирования Гольджи , вновь синтезированные мембраны проходят через один экспортно-импортный цикл и затем разрушаются. Иными словами, клетка использует имеющиеся в ее распоряжении свободные контейнеры.
Однако концепция оказалась несостоятельной, когда удалось оценить степень выраженности передвижения контейнеров. Железистая клетка способна удваивать поверхность своей плазматической мембраны при каждой секреторной разгрузке. Макрофаг заглатывает каждый час в два раза большую поверхность, чем поверхность его плазматической мембраны. Подобные скорости по меньшей мере на порядок больше, чем скорости обмена составных частей мембран. Вот почему клеточные контейнеры не могут быть свободными; они должны находиться в состоянии оборота.
Пути рециклирования (перемещения) мембран все еще выясняются. Возможно, наряду с прямыми челноками они включают окольные пути. Центр этого рециклирования мембран лежит в области клетки, иногда называемой ГЭРЛ (сокращение от слов: Гольджи — эндоплазматический ретикулумлизомосы), основным компонентом которой теперь принято считать эндосомы. Удивительно, что это быстрое и сложное рециклирование контейнеров лишь незначительно нарушает идущий в одном направлении транспорт содержимого, хотя, как мы уже видели , и наблюдается некоторое «слюнотечение». Судя по всему, клетка располагает эффективными механизмами для передвижения пустых контейнеров, возможно в виде уплощенных везикул. По-видимому, кислая среда в эндосомолизосомальной части экзоплазматического домена (отдела) играет ключевую роль в «раздевании» и освобождении мембран от лигандов перед их рециклированием.
Еще более значительной представляется способность клетки сохранять высоко- дифференцированную организацию ее вакуома. Каким-то образом, несмотря на бесчисленные слияния между мембранами различного состава, вряд ли существует какое-либо «перемещение» компонентов путем латеральной диффузии через их соединение. Поддерживаются (или даже соз-даются) отчетливые «разрывы», как при группировке занятых рецепторов, которые играют важную роль в избирательном транспорте. Где бы ни происходила сортировка — на поверхности клетки, в эндосомах, в Гольджи, возможно еще где нибудь, — в этом процессе всегда участвуют несущие рецепторы мембранные «пэтчи». Возможно, на эти участки оказывают определенное влияние расположенные под мембраной и прикрепленные к ней элементы цитоскелета .
Теперь, когда мы внимательно взглянули на вакуом, нам стало понятнее наше ощущение не вполне полного пребывания внутри клетки на этом этапе проделанного путешествия. Особенно заметно это было в экзоплазматическом домене, где мы наблюдали поистине удивительную картину перемещения, когда кусочек мембраны, которому в данный момент случилось оказаться в составе клеточной мембраны, в следующий момент мог стать частью эндосомо-лизосомальной системы, чуть позже появиться в Гольджи и в конце концов вернуться обратно на поверхность клетки, и все это за несколько минут! Пер- меазы, насосы и другие транспортные системы, присутствующие на плазматической мембране, по-видимому, продолжают свою работу при попадании внутрь, катализируя те же обменные реакции между цитозолем и содержимым везикул, как они это делают, находясь на клеточной поверхности, между цитозолем и внеклеточной средой. (Однако эффекты могут быть не одинаковы; вспомним протонный насос.) На самом деле, «с точки зрения функционирования», мы только наполовину находимся в клетке — или наполовину вне клетки, — пребывая внутри экзоплазматического домена вакуома. То же характерно и для его содержимого, которое либо только что попало в клетку путем эндоцитоза, либо вскоре будет удалено из клетки путем экзоцитоза. Мы оказываемся чуть глубже в клетке, попадая в эндоплазматический домен, за счет того, что «замок», или «ловушка» Гольджи защищает нас от захвата внеклеточными объектами. С другой стороны, безвозвратная передача содержимого эндоплазматического ретикулума в экзоплазматический домен, чаще всего с последующим выбросом во внеклеточное пространство, отчетливо придает полостям эндоплазматического ретикулума характер превнекле точного пространства.

Упаковка и доставка

Упаковка и доставка

Место, где мы сейчас находимся, получило свое название по имени итальянского гистолога Камилло Гольджи, который на пороге текущего столетия открыл эту систему в нервных клетках, пропитанных солями металла, и описал ее в виде тонкой сети, названной внутренним сетчатым аппаратом.
Истинная пространственная форма аппарата Гольджи (часто называемого просто Гольджи) все еще выясняется. Он несколько характерных компонентов, н структурные Детали варьируют от клетки клетке, и точные границы этой системы не установлены. Гольджи представля собой комплекс крупных и мелких окруженных мембраной полостей «беспорядочного^ вида (за которым на самом деле скрывается высокая степень упорядоченности) часто располагающийся в «товарном складе» и «упаковочных центрах».
Самым крупным и наиболее типичны компонентом Гольджи является диктиосома , названная так благодаря представлениям Гольджи об это системе. Конечно, аппарат Гольджи такаяже сеть, как и эндоплазматический ретикулум; он просто кажется сетью на поперечном срезе. Диктиосома представляет собой скопление нескольких крупных уплощеных, мембранозных цистерн, тесно спрессованных друг с другом наподобие стопи крупных двустенных чаш. Эта структур» напоминает стопку и потому, что имен изогнутые поверхности: одну вогнутую, другую выпуклую. Сейчас мы находима в первой цистерне на выпуклой поверхности вблизи эндоплазматического ретикулума. Стенки этой структуры незначительг» отличаются от стенок гладкого ЭР. Одна по мере продвижения от одной полости другой в направлении от выпуклой к вогнутой поверхности стопки мембраны становятся толще и грубее, увеличивает» количество холестерина в липидном бисл и углеводных боковых цепей в мембранн белках. Окружающие нас мембраны яви становятся все более похожими на плазм» тическую мембрану. Эта полярность отражает присущую аппарату Гольджи функцию упаковки. Секреторные продукты, проходя через аппарат Гольджи, передвигаются от «контейнеров», похожих по структуре на эндоплазматический ретикулум, к «контейнерам», построенным подобно плазматической мембране. Такое изменение, вероятно, необходимо перед выходом продукта из клетки путем слияния с плазматической мембраной и экзоцитоза.
Как именно секреторные продукты движутся через аппарат Гольджи — вопрос, страстно обсуждаемый учеными. По мнению некоторых, цистерны вместе с содержимым передвигаются от одной позиции к другой в пределах «стопки»; при этом их мембраны непрерывно изменяются и в конце концов распадаются на везикулы, которые и доставляют продукты к пункту назначения. Приверженцы этой точки зрения описывают стопку Гольджи как структуру, в которой имеются формирующаяся (из эндоплазматического ретикулума) и созревающая поверхности. Другие исследователи рассматривают стопку Гольджи как более статичную систему, через которую продукты движутся либо по постоянным соединениям, либо используя везикулярный транспорт и следуя по маршрутам, которые могут изменяться в зависимости от продукта и не обязательно проходить через все цистерны стопки Гольджи. Согласно этой концепции, они используют чисто топологические понятия цис и транс (относительно эндоплазматического ретикулума), чтобы различать поверхности стопки Гольджи. Во избежание путаницы с цисимембранными слияниями мы будем употреблять термины «эндоплазматический» н] «экзоплазматический».
В целом, как нам представляется, статическая модель ближе к истине. Изменения в структуре мембраны, отражающие! полярность системы, не являются постепенными изменениями, постулированными а] динамической модели. Они затрагивают! глубокие и значительные различия, при которых, например, целые группы ферментов замещаются другими группами. На! основании имеющихся данных скорее всего] можно заключить, что мембраны Гольджи| не подвергаются подобной выраженной реорганизации — по крайней мере со скоростью, сопоставимой со скоростью пере-1 движения секреторных продуктов по это!
системе. Отсюда следует, что содержимое и вместилище не могут двигаться одновременно; такой вывод противоречит мнению, постулированному динамической моделью.
По мере продвижения по аппарату Гольджи секреторные белки подвергаются значительной доработке, включая частичное укорочение некоторых боковых цепей олигосахаридов, которые были собраны в ЭР, добавление фосфатных групп (так называемое фосфорилирование) или жирных кислот (ацилирование) и дальнейшее протеолитическое расщепление.
Второй важной функцией Гольджи является сортировка. Как это происходит, известно до некоторой степени только для кислых гидролаз, предназначенных для пищеварительной системы лизосом. Но попытаемся воспроизвести, отчасти гипотетически, ход событий. В Гольджи лизосо-мальные ферменты получают характерную адресную метку в виде концевых маннозофосфатных групп, прикрепленных к некоторым олигосахаридным боковым цепям. Фермент, ответственный за их прикрепление, не метит аналогичным образом другие гликопротеины: он «узнает» специфическую структуру (предположительно аминокислотную последовательность или тип последовательности), типичную для всех лнзосомальных гидролаз. Последующее опознавание маннозофосфатной метки производится специфическими сайтами (местами) связывания, сгруппированными на внутренней поверхности некоторых участков мембраны Гольджи. Посредством этих сайтов из смеси секреторных белков «выуживаютса» лизосомальные ферменты. Нагруженные ими участки мембран отрываются в виде везикул, которые избирательно движутся к лизосомам (или к эндосомам) и, сливаясь с ними, разгружают содержимое при контакте с кислой средой лизосом. По-видимому, затем опорожненные везикулы возвращаются к аппарату Гольджи.
Однако этот удивительный механизм сортировки несовершенен; некоторые молекулы лизосомальных ферментов сопровождают основной секреторный поток и выходят во внеклеточное пространство. Если они были тщательно помечены, их можно еще спасти, поскольку, как мы уже вкратце упоминали в гл. 5, рецепторы для маннозо- 6-фосфата также обнаруживаются на плазматической мембране многих клеток. Среди исследователей все еще дискутируется возможность перехода большей части загруженных рецепторов из Гольджи к лизосомам через поверхность клетки, хотя существование прямого внутриклеточного пути кажется весьма вероятным. Во всяком случае, благодаря существованию внеклеточного пути истинная секреция лизосомальных ферментов отчасти происходит даже при нормальных условиях. При патологических состояниях, когда нарушается транспорт ферментов к лизосомам, она может значительно усиливаться. Последствия такого истечения, однако, менее драматичны, чем при разгрузке лизосом (дефекации), так как некоторые лизосомальные гидролазы, включая особенно опасные катепсины (протеазы), синтезируются в форме неактивных проферментов, которые активируются только после попадания в лизосомы.
Помимо доставки к месту назначения упаковка должна соответствовать способу доставки секреторных продуктов, непрерывному или прерывистому. При непрерывной секреции продукты постоянно выходят из аппарата Гольджи, упакованные в мелкие мембранозные везикулы, которые отпочковываются от Гольджи, и разгружают содержимое во внеклеточное пространство путем экзоцитоза. При прерывистой секреции продукты концентрируются в больших конденсирующих вакуолях, которые превращаются в зрелые секреторные гранулы — крупные, плотноупакованные,окруженные мембраной структуры, имеющие характерные для железистых клеток черты. Гранулы высвобождают свое содержимое путем экзоцитоза, но только при соответствующей стимуляции — часто сложной цепи нервных и гормональных переключений, которые завершаются локальным выходом ацетилхолина. Этот перенос-чик соединяется с рецептором .на клеточной поверхности , и наступившее в результате конформационное изменение запускает механизм выхода секреторных гранул путем экзоцитоза, возможно впуская ионы кальция в клетку. Если же стимул не поступает и клетка продолжает вырабатывать секреторные гранулы, они начинают сливаться с лизосомами, а не с плазматической мембраной, и излишки секреторных продуктов разрушаются кринофагией .
Лизосомальные гидролазы обычно транспортируются в лизосомы постоянно. Но существует одно поразительное исключение: полиморфноядерный лейкоцит. Эта клетка крови производит и хранит лизосомальные гидролазы в течение нескольких поколений в ходе своего развития и дифференцировки от стволовой клетки, находящейся в костном мозгу; то же касается лизоцима и ряда других бактерицидных агентов. Лейкоцит накапливает эти вещества в двух типах крупных цитоплазматических гранул, известных как азурофильные и специфические гранулы. Гранулы остаются по существу инертными в цитоплазме до тех пор, пока клетка, соблазненная соответствующими антителами-приправой (опсонизация), не начнет пожирать себя и бактерии или другие инородные частицы . В результате происходит массированный выход содержимого гранул в фагоцитарные вакуоли и, как следствие, убийство и переваривание добычи (гл. 5). Как мы уже знаем, после участия в такой борьбе лейкоцит в отличие от других фагоцитирующих клеток не восстанавливается. Высокая степень специализации, превратившая его в контролируемый секреторный объект, одновременно сделала его и объектом, секретирующнм всего лишь раз. В конце своей фагоцитарной схватки лейкоцит погибает.

Образование мембраны

Образование мембраны

Как известно, мембраны никогда не образуются de novo. Они всегда возникают из предсуществующих мембран путем добавления дополнительных составных частей. Этот процесс, возможно, столь же стар, как и эволюция. Каждое поколение передает последующему, в основном через яйцеклетку, запас ранее сформированных (предсуществующих) мембран, из которых отпочковываются от Гольджи, и разгружают содержимое во внеклеточное пространство путем экзоцитоза. При прерывистой секреции продукты концентрируются в больших конденсирующих вакуолях, которые превращаются в зрелые секреторные гранулы — крупные, плотноупакованные, окруженные мембраной структуры, имеющие характерные для железистых клеток черты. Гранулы высвобождают свое содержимое путем экзоцитоза, но только при соответствующей стимуляции — часто сложной цепи нервных и гормональных переключений, которые завершаются локальным выходом ацетилхолина. Этот перенос-чик соединяется с рецептором,на клеточной поверхности (см. гл. 3), и наступившее в результате конформационное изменение запускает механизм выхода секреторных гранул путем экзоцитоза, возможно впуская ионы кальция в клетку. Если же стимул не поступает и клетка продолжает вырабатывать секреторные гранулы, они начинают сливаться с лизосомами, а не с плазматической мембраной, и излишки секреторных продуктов разрушаются кринофагией .
Лизосомальные гидролазы обычно транспортируются в лизосомы постоянно. Но существует одно поразительное исключение: полиморфноядерный лейкоцит. Эта клетка крови производит и хранит лизосомальные гидролазы в течение нескольких поколений в ходе своего развития и дифференцировки от стволовой клетки, находящейся в костном мозгу; то же касается лизоцима и ряда других бактерицидных агентов. Лейкоцит накапливает эти вещества в двух типах крупных цитоплазматических гранул, известных как азурофильные и специфические гранулы. Гранулы остаются по существу инертными в цитоплазме до тех пор, пока клетка, соблазненная соответствующими антителами-приправой (опсонизация), не начнет пожирать себя и бактерии или другие инородные частицы (гл. 4). В результате происходит массированный выход содержимого гранул в фагоцитарные вакуоли и, как следствие, убийство и переваривание добычи (гл. 5). Как мы уже знаем, после участия в такой борьбе лейкоцит в отличие от других фагоцитирующих клеток не восстанавливается. Высокая степень специализации, превратившая его в контролируемый секреторный объект, одновременно сделала его и объектом, секретирующим всего лишь раз. В конце своей фагоцитарной схватки лейкоцит погибает.

Бегство из лизосом

Бегство из лизосом

Еще каких-нибудь несколько лет назад никто в здравом уме не отважился бы войти в клетку путем эндоцитоза, не заручившись твердой гарантией, что лизосомальный компартмент можно обойти. Ибо, перефразируя знаменитое дантевское изречение, нужно было «оставить надежду всякому, туда входящему» — во всяком случае в это верили. Даже если бы вам удалось вырваться обожженным кислотой или разрезанным на куски гидролазами, вы навсегда остались бы узниками «мембра- нозной тюрьмы», бесконечно перегоняемыми из одного отсека в другой капризной игрой цис- и транс-слияний. Об этом свидетельствует бесчисленное множество достоверных примеров, включая целый ряд патологических состояний, связанных с перегрузкой лизосом.
Однако, как мы теперь знаем, такая точка зрения не вполне справедлива. Из лизосом существует выход, причем не один, а несколько, связанных с различными внутриклеточными путями, ведущими либо к плазматической мембране, либо к аппарату Гольджи. Все, что необходимо сделать, — это схватиться за подходящий участок мембраны («пэтч»), который вскоре отделится и вытащит нас из лизосомального пространства. Трудность, вероятно, состоит в том, чтобы крепко держаться за мембрану в лизосомальной среде. Многие вещества, которые связываются с рецепторами плазматической мембраны, отщепляются под влиянием кислой среды в лизосомах или ферментативной обработки. Содержимое лизосом губительно сказывается даже на некоторых рецепторах, которые в результате разрушаются. Таким образом, к тому моменту, когда участок мембраны отделяется от лизосомальной мембраны для возвращения на периферию клетки, он передвигается «голым», с гладкой поверхностью. По крайней мере так мы интерпретируем тот факт, что столь мало удаляется из лизосом, несмотря на непрерывное рециклирование окружающих их мембран. Мы должны допустить далее, что мембранные участки («пэтчи») передвигаются в такой форме — возможно, в виде очень мелких везикул, — что для транспортировки жидкости остается лишь небольшое пространство. Это обстоятельство может осложнить наше бегство из лизосом. Но мы все-таки рискнем.
Проследовав за мембраной весь путь до поверхности клетки, мы снова вернемся туда, откуда начали свой маршрут. Однако некоторые рециклирующие мембраны перемещаются окольным путем и останавливаются в аппарате Гольджи, возможно, чтобы, воспользовавшись случаем, восстановить повреждение мембраны, полученное при прохождении через лизосомальный компартмент. Кроме того, существует прямой челнок лизосома — аппарат Гольджи, доставляющий свежие ферменты из аппарата Гольджи в лизосомы. Воспользуемся этим средством, которое «рекламируется» специфическими рецепторами для лизосомальных ферментов на перемещающихся участках («пэтчах») мембран. Это позволит нам добраться вполне удобно, если не комфортабельно, к нашему следующему объекту: экспортному департменту (отсеку) клетки.

Процессинг и транспортировка

В большинстве случаев полипептидные цепи представляют собой лишь полуфабрикаты секреторных продуктов; они требуют значительной дальнейшей доработки и «отделки» перед тем, как будут готовы к отправке. Одни из них снабжаются боковыми углеводными цепочками, содержащими 10 и более молекул сахара (гликозилирование), другие связываются с липидами, иногда во много раз превышающими их массу, как, например, липопротеины плазмы, вырабатываемые в печени. Все цепи должны принять соответствующую конфигурацию, причем для некоторых молекул необходимо участие специальных химических мостиков-связей, обычно дисульфидных связей: 8 — 5. И наконец, в результате дополнительной протеолитической обработки многие молекулы уменьшаются.
Некоторые изменения, в частности глнкозилирование, начинаются еще до полной сборки полипептидных цепей. Другие происходят по мере продвижения молекул с током секреторных продуктов во время скольжения их вдоль мембран, на которых расположены ферменты, участвующие в доработке. В этот процесс вовлечен целый комплекс биохимических реакций, но даже с нашей выгодной позиции внутри цистерн ЭР мы часто в состоянии видеть лишь немногим более, чем финальные стадии. В основном события развертываются на цитоплазматической поверхности мембран, где в изобилии имеются строительные блоки и энергетические запасы; само внутреннее пространство ЭР служит главным образом собирательным каналом и местом сборки. Такая организация напоминает происходящее на автомобильном заводе, где двигатель, кузов, шасси, колеса и другие части машины производятся в отдельных цехах к затем просто собираются на конвейере с ‘ минимальной затратой рабочей силы.
То, что мы обнаружили, характерно для полипептидных цепей, которые синтезируются рибосомами на цитозольной стороне мембраны ЭР и в готовом виде переправляются в цистерны ЭР. Липидные компоненты и углеводные боковые цепочки также собираются на цитозольной поверхности и транспортируются через мембрану. Каков способ переправки углеводов через мембраны? Этот вопрос ставит нас в тупик, ибо сахара гидрофильны и не могут беспрепятственно пройти через липидный бислой. Известно, что в этом процессе участвует гидрофобный переносчик молекул, долихол, но как он работает, не ясно. Подробнее мы остановимся на этом, когда будем рассматривать механизмы биосинтеза (гл. 8 и 13).
Реакции внутри полостей ЭР, будучи весьма ограниченными в количественном отношении, высокоспецифичны и избирательны. Каждый полипептид дорабатывается характерным и воспроизводимым образом. То, что на первый взгляд кажет- ; ей само собой разумеющимся (а именно беспорядочная, случайная доработка может привести только к хаосу), в действительности исполнено глубокого смысла. Если полипептид А, но не полипептид В, претерпевает определенное изменение, то только потому, что участвующий в этой реакции фермент «узнает» — иными словами, связывается в каталитически эффективной форме —нечто, что имеется в А и отсутствует в В. И это нечто может быть только аминокислотной последовательностью, к крайней мере в начале. Последующий определяется предыдущим, как, например, прикрепление данной молекулы сахара. Но прежде всего инструкции должны быть заложены в самом полипептиде, чья структура уже есть выражение Лиетического сигнала. Следовательно, этот сигнал определяет не только структурные и функциональные свойства полипептида при рождении, но и всю цепь событий, участвующих в доработке и модификации его молекулы, ее перемещении внутри и вне клеток, соединении с другими молекулами и включении в различные части клетки, а также в иных превращениях. Другими словами, гены определяют всю «пространственную (четырехмерную) историю» белковых молекул.
А теперь вернемся к секреторным полипептидам, которые будем сопровождать в их дальнейшем путешествии. По мере нашего продвижения вперед мы замечаем, как постепенно истончаются шелковистые выросты на поверхности мембраны. Полипептидные пучки встречаются все реже и. реже и в конце концов исчезают, что означает исчезновение полисом, передвигающихся по цитоплазматической поверхности мембран. Это изменение отчетливо про слеживается на поперечных срезах. В тех участках, где имеются полисомы, обнаруживаются выступы в виде плотных точек, выстроенных вдоль мембран и придающих им шероховатый вид; мембраны, не несущие полисом, гладкие. Отсюда термины «шероховатый (гранулярный) эндоплазма- тический ретикулум» (ШЭР) и «гладкий эндоплазматический ретикулум» (ГЭР), присвоенные этим двум частям ЭР. Как уже отмечалось, переход от одной части к другой происходит постепенно. Однако к моменту нашего вступления в гладкую часть ЭР картина существенно меняется. Мы достигаем конца просторной эндоплазматической полости и приближаемся к извилистым проходам, которые пересекли во время нашего путешествия вверх по течению. Теперь мы находимся на подступах к аппарату Гольджи, но уже на законных основаниях, вместе с секреторным потоком.
Форму переходных элементов, соединяющих эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи, различить нелегко. На некоторых этапах нашего путешествия мы как бы протискивались сквозь извитые протоки, на других же перемещались в маленьких изолированных капсулах. Другими словами, непонятно: средства связи, к которым мы прибегаем, постоянны и имеют трубчатую форму или непостоянны и представляют собой везикулы, которые используют трюк мыльных пузырей «слияние — разделение» для транспортировки секреторных продуктов из одного компартмента в другой? Этот вопрос до сих пор обсуждается и ответ может быть различным для разных клеток. Здесь мы вновь сталкиваемся со сложностью воспроизведения пространственной картины на основе имеющихся двумерных поперечных срезов. Разрежьте поперек свернутую трубку или расположенные в ряд везикулы, и вы увидите одну и ту же картину: ряд округлых профилей.

Замыкание цикла

Существует несколько способов выхода из аппарата Гольджи в зависимости от того, какими опознавательными знаками мы воспользуемся, собираясь покинуть Гольджи. Если мы не хотим вернуться в лизосомы, нам следует избегать маннозофосфата. За этим исключением, все остальные выходы приводят к некой точке вне клетки, и мы можем воспользоваться
прерывистой секрецией, представляющей нам наибольшие возможности для приспособления. Но даже в этом случае наше путешествие далеко не из приятных. Прежде всего мы должны попасть в конденсирующую вакуоль и выдержать почти непереносимое давление, по мере того как из вакуоли будет выкачиваться вода, а продукты секреции вокруг нас уплотнятся до почти твердого состояния. Затем наступает ожидание в состоянии острого физического дискомфорта и нарастающего страха перед кринофагией, которая может помешать нашему бегству и отбросить нас в лизосомальное пространство. Когда же наконец открывается выход из клетки, то это происходит с необыкновенной силой и стремительностью. Экзоцитарная разгрузка секреторных гранул представляет собой взрывной процесс. Гранулы скапливаются и толкают друг друга, стремясь возможно скорее попасть на периферию клетки. Часто они сливаются с другими гранулами, лежащими на их пути, вызывая глубокие дефекты на поверхности клетки и выгружая массы секреторных продуктов. Внешнему наблюдателю это явление на-поминает внезапное извержение гряды вулканов, истинное «клеточное землетрясение». Беспомощным спутникам секреторных продуктов сам экзоцитоз приносит последнее напряжение, к счастью, кратковременное и легко забываемое в сладости вновь обретенной свободы. И вот уже обратно в целительное, успокаивающее внеклеточное море, где мы вновь созерцаем покрытую углублениями движущуюся поверхность клеточной мембраны с ее извивающимися отростками и колышащейся вуалью. Мы завершили цикл: вошли в клетку путем эндоцитоза, бродили, плутая, по нескончаемой веренице ее комнат и коридоров и вышли путем экзоцитоза.
Это было увлекательное, но в известном смысле нереальное путешествие, подобное странствию по сюрреалистическому лабиринту. Всюду пустые стены, нескончаемые вереницы мембран, всегда плотно упакованных, таинственно мерцающих, скрывающих от нашего взора многочисленные механизмы, которые, судя по их продукции, должны обладать удивительной сложностью. Ясно одно: пока мы с трудом вошли в клетку, и нам следует отыскать путь, позволяющий преодолеть эту вечную преграду. Но перед тем, как сделать это, окинем последним оценивающим взглядом всю цитомембранную систему.

Экспорт у прокариотов и происхождение эукариотических клеток

Наличие вакуома является характерной чертой эукариотических клеток. Большинство бактерий совсем не имеют внутриклеточных мембран. Эукариоты произошли от прокариотов около миллиарда лет назад. Рассматривая экспортный механизм у прокариотов, мы получим некоторое представление о том, как произошла эта важная трансформация, ключевая для появления всех растительных и животных клеток на земном шаре.
Большинство бактерий секретируют белки в окружающую их среду. Среди этих белков преобладают гидролитические экзоферменты, выполняющие пищеварительную функцию. Интересно и, возможно, весьма показательно, что эти экзоферменты производятся и выталкиваются полисомами, прикрепленными к внутренней поверхности плазматической мембраны бактерий, во многих отношениях так же, как начальные экспортные белки переносятся через мембрану эндоплазматического ретикулума. Сходство даже распространяется на молекулярные механизмы этого процесса, что наводит на мысль о происхождении шероховатого (гранулярного) эндоплазматического ретикулума эукариотов из плазматической мембраны их прокариотических предков, возможно в результате некоего прогрессивного процесса впячивания мембраны в клетку. Для такого процесса необходима подвижность клеточной оболочки, что дает возможность предположить отсутствие ригидной оболочки у наших предполагаемых отдаленных предков. Такие «голые» бактериальные клетки могут образоваться под влиянием лизоцима (протопласты), а также возникать случайно в природе . Они очень хрупкие, но при определенных обстоятельствах их ранимость может быть компенсирована необыкновенным эволюционно приобретенным преимуществом — подвижностью поверхностного слоя. Возможно, именно этим объясняется образование углублений в плазматической мембране и особенно внутриклеточной везикулизации таких углублений-впячиваний, характерных для эндоцитоза; при этом экзоферменты, вырабатываемые в связанных с мембранами полисомах, остаются внутри везикул, где они воздействуют на любой внеклеточный мате-риал, захваченный в процессе поглощения. Последний можно рассматривать как простейшую возможную форму внутриклеточного пищеварения внутри вакуолей, имеющих свойства эндосом, лизосом и цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума.
Даже в столь примитивной и случайной форме такое приобретение дает явное эволюционное преимущество, благоприятствующее любой возможности мутации, которая приводит к дальнейшему развитию. До сих пор клетка, чтобы извлекать пользу из переваривающей способности своих экзоферментов, должна была полагаться на внеклеточное переваривание. Если клетки не имели других средств для существования, они практически были обречены на пребывание внутри снабжающей их пищи, как личинки мух в головке сыра. Начиная же с этого времени они получали свободу, могли бродить «по свету» и активно преследовать свою добычу, живя на фагоцитированных бактериях или других поглощенных материалах. Образно говоря, такое, развитие предвещало начало клеточной «эмансипации».
Другим важным последствием постулированного изменения может быть возможность роста. Клетки зависят от обмена с окружающей их средой и ограничены в своей способности к росту площадью поверхности, доступной для таких обменов. Мы уже могли убедиться в важной роли микроворсинок и других поверхностных выростов для обменных процессов. Развитие внутриклеточной вакуолярной системы, находящейся в непосредственной связи с внешней средой через эндоцитарные образования и ограниченной мембраной плазматического типа, которая снабжена всеми необходимыми транспортными системами, может многократно усилить обменную способность клеток и таким образом позволит ей достичь значительных размеров. Одновременно происходит и прогрессивная дифференцировка цитомембранной системы: рибосомы постепенно направляются к более глубоким участкам системы, а периферические части системы развиваются в плазматическую мембрану и участки с гладкой поверхностью вакуома современных эукариотов.
Согласно этой гипотезе, важнейший эволюционный шаг от прокариотов к эукариотам был сделан с участием «крупного примитивного» фагоцита. Возможно, мы никогда не узнаем, что же произошло на самом деле. Но интересно, что самая популярная теория эволюционного приобретения таких важных органелл эукариотов, как митохондрии и хлоропласта, зависит от появления именно такого типа клетки . Более того, если рассматриваемая гипотеза окажется верной, наше представление о вакуоме как о тем или иным образом простирающейся основной границе между клеткой и окружающей средой, насчитывающей тысячи внутриклеточных мешочков, укоренится в истории эволюции.

Волшебная пряха

«Фабрики», где клетки производят продукты на экспорт, обычно не доступны для посетителей извне. Аппарат Гольджи, в который мы прибыли из лизосом, лежит на полпути к конвейеру. Если мы хотим проследить производственный процесс с самого начала, нам следует прежде всего форсировать путь вверх по течению. Наше незаконное путешествие сопряжено с многими трудностями, приходится преодолевать немало узких полостей и извилистых туннелей. Но этот небольшой участок вскоре заканчивается по мере проникновения в глубокое ущелье впечатляющих размеров — часть эндоплазматического ретикулума (сети), или ЭР.
Термин «ретикулум» по-латыни Означает сеть. Выбор этого термина отражает двумерное представление морфологов об ЭР, которые наблюдали эту систему в поперечном сечении в виде Уонких нитей «филиграни. Эти линии представляют собой ■ края мембран, срезанных перпендикулярно их плоскости. Трехмерная (пространственная) реконструкция показала, что мембраны образуют большие уплощенные мешочки, или цистерны, полностью изолированные, за исключением соединений — постоянных или временных, — которые связывают их друг с другом и с аппаратом Гольджи.
Рассматриваемые изнутри плоские мембранозные стенки цистерн ЭР кажутся построенными по такому же бислойно- белковому плану, что и плазматическая мембрана и стенки эндосом и лизосом. Однако мембраны ЭР тоньше, глаже и подвижнее; фосфолипиды в их бислое имеют иное строение, а связанный с ними холестерин практически отсутствует.’.Белки также отличаются и в значительной степени лишены боковых углеводных цепочек. Эн- доплазматические мембраны лишены характерного «щетинистого» вида плазматической мембраны. В отличие от последней они покрыты пучками очень тонких шелковистых нитей, которые придают им вид мерцающей паутины. Мерцание — это не просто оптический эффект, оно отражает движение: шелковистые нити растут, и с довольно ощутимой скоростью, приблизительно 1 нм/с, что при нашем увеличении в миллион раз составляет свыше 5 см/Мин. Они растут стабильно до тех пор, пока не достигают длины 50—200 им, после чего отпадают и уносятся с потоком. Мы погружаемся в море движущегося шелка.
На наших глазах здесь происходит производство белков на экспорт. Шелковые нити, растущие из окружающей нас мембраны, не что иное, как полипептидные цепочки. Они образуют извилистые ряды, состоящие из 10—20 нитей, характерно располагающихся в порядке увеличения длины. Все нити определенной группы растут с одинаковой скоростью, но с различием по фазе (запаздыванием), пропорциональным расстоянию между ними. Примерно каждые 15. с последняя нить ряда достигает полной длины и отпадает, а верхушка новой нити возникает из мембраны где-то впереди. По мере роста отдельных нитей ряд передвигается, ползая по поверхности мембраны наподобие удивительной пушистой сороконожки. Сотни таких похожих на привидения созданий исполняют непрерывно меняющиеся арабески на окружающих нас стенках. Незабываемое зрелище!
Если мы теперь рассмотрим место, в котором растущие нити входят в полость, где мы находимся, то заметим, что они проникают через узкий канал, сформированный белком и проложенный в липидном бислое. На самом конце каждого канала с трудом можно различить очертания луковицеобразного корня примерно около 25 нм (2,5 см при нашем увеличении) шириной; по-видимому, здесь и начинается процесс прядения нитей. Итак, позади каждого ряда растущих нитей располагается ряд луковиц (расширений), отделенных от нас мембраной. Всматриваясь в мембрану, мы можем различить еще одну деталь: между луковицами каждого ряда натягивается, вернее, скользит мимо них с удивительной скоростью — 250 нм (25 см при нашем увеличении) в 1 мин — нежный тонкий шнур. Его движение синхронно с ростом нитей и с боковым перемещением точек их появления на’ мембране. На самом деле, шнур с вереницей луковиц и представляет собой настоящую сороконожку — похожее на призрак создание, чьи растущие волосы мы только и видим. Имя этого скрытого демона — полисома, сокращенное от полирйбосомы.
Рибосомы представляют собой мелкие частицы, в которых происходит синтез белка во всем живом мире. Их работа заключается в соединении аминокислот в полипептидные цепочки. Соответствующие инструкции об этом рибосомы получают от переносчиков РНК, или мРНК, которые являются сегментами рибонуклеиновой кислоты (отсюда сокращение РНК) и несут фрагменты генетической информации, транскрибированной (сиисанной) с дезокси- рибонуклеиновой кислоты (ДНК). мРНК— это тонкие нитевидные молекулы, бегущие через рибосомы наподобие ленты в магнитофонной кассете. Однако вместо передачи информации одной рибосоме в единицу времени они пробегают через 10 или более рибосом одновременно и таким образом связывают их в единую нить, полисому. Представьте себе ленту, бегущую через ряд кассет, каждая из которых закреплена за отдельным исполнителем. Каждый из них исполнит одну и ту же музыку, но в форме канона или фуги с интервалом, пропорциональным расстоянию между кассетами: в то время как последний в ряду только начинает увертюру, первый уже в коде. Именно так происходит в полисомах, за исключением того, что они воспроизводят записанное на ленте послание в виде специфической последовательности аминокислот, а не звуков. Все рибосомы одной полисомы читают один и тот же текст, иными словами, воспроизводят один и тот же полипептид. Причем делают это с одинаковой скоростью, но не синхронно друг с другом: чем больше протяженность транслированной (прочитанной) ленты, тем длиннее синтезированная часть полипептида. Следует отметить, что полипептиды растут в области своих корней (т. е. на рибосомах), а не в области верхушек. Если сравнить две растущие цепи, исходящие из одной полисомы, то легко обнаружить, что более короткая цепь идентична терминальному участку более длинной цепи.
Детальнее эту картину можно рассмотреть при посещении цитозоля. Сейчас же мы воспользуемся преимуществом нашего местопребывания, чтобы ответить на вопрос, вызвавший бурные обсуждения среди ученых: действительно ли все отдельные пучки, растущие на стенках одной цистерны ЭР, состоят из одинаковых полипептидов? Или они различны, но предназначены для одной и той же цели? Или же это совершенно случайная смесь полипептидов? Сталкиваясь с проблемой отправки различных продуктов в разные пункты назначения, клетки, казалось бы, смогли найти простое решение этой проблемы, разделяя производство по образцу химических предприятий. Но, судя по всему, экспортная индустрия клеток так не работает. Она направляет все продукты в один котел, а позже их сортирует.

Каталог веществ

Сначала мы обнаруживаем множество веществ, образованных для экспорта на небольшие расстояния и используемых клетками для организации или очистки непосредственного окружения. Перегородки, волокна, матриксы и все остальные компоненты каркаса, удерживающего клетки вместе и придающего тканям и органам их характерную архитектуру, собираются из растворимых предшественников, таких, как проколлаген , которые образуются и разгружаются на месте. Ферменты, разрезающие и соединяющие эти строительные блоки, также образуются и секретируются на месте благодаря экспортному аппарату клеток. «Специалистами» такой конструкторской работы по праву следует назвать остеобласты, создающие каркас кости, хондробласты, формирующие мат- рикс хряща, и фибробласты, образующие волокна соединительной ткани.
Как правило, в живом мире созидание предусматривает и разрушение. Этот процесс происходит внеклеточно при помощи литических ферментов, которые также являются продуктами клеточного экспорта.С точки зрения отдельных клеток литические ферменты выступают в качестве средства инвазии (вторжения); они разрезают внеклеточные структуры и расчищают пути для продвижения клеток. Без такой секреции лейкоцит, выведший нас из кровяного русла, не смог бы прорваться через базальную мембрану капилляра. Раковые клетки, вероятно, осуществляют характерную для них инвазивность благодаря особо агрессивной активности подобного рода. Но такие же средства разрушения весьма полезны также оседлым клеточным сообществам, поскольку они наделяют их способностью очищать, восстанавливать и переделывать свою среду обитания.
Все клетки стремятся, образно говоря, очистить свои «пороги», но специализированные клетки делают разрушение внеклеточных структур основным занятием всей своей жизни. Мы уже встречали остеокласты, которые прорывают себе путь через костный матрикс с помощью смеси лизосомальных гидролаз . Фибробласты, как ни удивительно, также выступают в виде «фиброкластов». При соответствующей стимуляции они выделяют мощную коллагеназу, специфически разрезающую кшагеновые волокна, и специфическую протеазу, воздействующую на структурные протеогликаны . Такая секреция физиологически очень важна, но одновременно в ней таятся серьезные патологические опасности, как мы наблюдали в случае перегрузки лизосом .
Другой крупный отсек клеточной экопортной индустрии связан с производством материалов, предназначенных для перевозки на значительные расстояния. Клетки, осуществляющие этот вид работы, обычно объединяются в специальные органы, именуемые железами, которые разделяются на две группы. В экзокринных железах секреторные продукты собираются в протоках и по ним переправляются к специфическим пунктам назначения. В отличие от них в эндокринных, или беспротоковых, железах продукты секреции выделяются в околоклеточные пространства, из которых они но кровеносным сосудам распространяются по всему организму.
Наиболее изученные секреты экзокринных желез, такие, как слюна или панкреатический сок (секрет поджелудочной железы), снабжают ферментами органы желудочно-кишечного тракта. Но существует и множество других желез. Железы располагаются в коже, в веках, в слуховых проходах, в половых путях и во многих других областях человеческого организма. Вырабатываемые в них продукты служат для смазки, защиты, водонепроницаемости, обеззараживания, создания «запаха» и химической связи, а также для переваривания.
Наиболее важными секретами эндогрннных желез являются гормоны. Но среди них необходимо различать полипептидные гормоны (такие, как инсулин или гормоны гипофиза; они производятся и транспортируются в структурах, которые мы собираемся вскоре посетить) и ряд других химических переносчиков-посредников — небольших молекул, включая тироксин, эпинефрин, ацетилхолин и половые гормоны (стероиды), которые либо диффундируют из клетки через плазматическую мембрану, либо высвобождаются, пользуясь особыми приспособлениями, которые мы не сможем рассмотреть в нашем путешествии.
Отдельная группа продуктов клеточного экспорта представлена белками плазмы крови; многие из них синтезируются в печени, за исключением антител, синтезируемых в плазматических клетках, образованных из В-лимфоцитов .
И наконец, существуют лизосомальные ферменты. Терминологически они не заслуживают названия «экспортные продукты», так как в основном используются внутри клетки. На практике же пространство, в которое они изливаются, находится в непосредственной близости от внеклеточного пространства, из которого оно образуется посредством эндоцитоза; лизосомальные ферменты могут работать даже вне клетки . С этих позиций лизосомальные ферменты характеризуются как секреторные продукты. Судя по всему, сама клетка рассматривает их в качестве таковых, ибо использует свой экспортный аппарат для снабжения ими лизосом.
Секреция представляет собой специализированный процесс, в ходе которого каждый продукт обычно вырабатывается одним или несколькими типами клеток. Но клетки часто производят несколько продуктов, иногда для различных целей. Это означает, что экспортный механизм клетки должен- включать целый ряд систем отправления, которые, например, посылают кислые гидролазы в лизосомы, белки крови и гормоны — в кровяное русло, экзокринные продукты — в соответствующие выводные протоки, а структурные элементы и ремоделирующие их агенты — в прилегающее околоклеточное пространство.
Некоторые процессы клеточного экспорта регулируются только продукцией; клетки распоряжаются своими «товарами» по мере их производства и не держат про запас. Именно таким образом ведут себя плазматические клетки, секретирующие иммуноглобулины, а также фибробласты — основные производители структурного коллагена. Однако другие клетки, в частности секретирующие4 гормоны или компоненты пищеварительных соков, хранят свои продукты в специальных гранулах и выделяют их только по команде. Мы рассмотрим непрерывную и прерывистую секрецию, чтобы выяснить различия между ними.
Во многих случаях клетки экспортируют не полностью доработанные продукты, оставляя конечную доработку, которая обычно не что иное как протеолитическое расщепление, до прибытия в пункт назначения. Они это делают особенно тщательно, если конечный продукт потенциально опасен и может вызвать локальное повреждение. В таких случаях клетки производят «безвредный» предшественник, который превращается в конечный продукт только там и тогда, когда в нем возникает необходимость. Именно таким путем производятся многие пищеварительные ферменты, включая некоторые лизосомальные гидролазы, — в виде неактивных проферментов, или зимогенов. Существуют разрушающие ткани ферменты (коллагеназа) и ряд систем крови, участвующих в образовании и диссоциации тромбов, в клеточном убийстве и других «опасных» процессах. Структурные компоненты, предназначенные для объединения в нерастворимые агрегаты, также вырабатываются в виде крупных предшественников, неспособных соединяться спонтанно. Примером может служить тропоколлаген, секретируемый в виде растворимого проколлагена . Доработка различных предшественников происходит • вне клеток при помощи ферментов, которые сами являются продуктами экспорта. Таким образом, участвующие в этом процессе клетки связаны сложными взаимодействиями.
Иногда, когда в целях безопасности необходимы особенно строгие гарантии, включается целый каскад реакций активации предшественников между начальным запуском и конечной стадией доработки. Типичным примером может служить процесс свертывания крови, в ходе которого происходит протеолитическое превращение растворимого белка крови, известного под названием фибриноген, в фибрин, формирующий нерастворимую сеть. Осуществляющий это превращение фермент тромбин присутствует в виде своего неактивного предшественника — протромбина. При повреждении ткани из клеток высвобождаются некоторые вещества, инициирующие! активацию протромбина посредством сложной цепи последовательных протеолитических реакций. Замечательным примером| такого механизма может служить активация комплемента — мощной «убивающей>’ системы крови, связанной с антителообразующими клетками . Эта система] включает не менее девяти различных цирлкулирующих белковых молекул; некоторые) из них состоят из нескольких субъединиц. В результате связывания одного из этих] компонентов с Рс-хвостами связанных иммуноглобулиновых молекул происходит запуск ряда последовательных взаимодействий, заканчивающихся созданием сложной структуры, похожей на подъемный кран; при ее помощи в плазматической’ мембране покрытой антителами клетки пробуравливается отверстие, «выпускающее жизнь». На основании этих и других подобных примеров можно предположить; что число ступеней между запускающим событием и финалом находится в прямой зависимости от опасности, связанной со случайным запуском процесса. Протеолитические каскады — это путь Природы по созданию множественных контрольных устройств «неудача — сохранение».

Экспортная индустрия клетки: эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи и секреция.

Живые клетки производят все виды экспортных материалов, они их собирают, дорабатывают, упаковывают и транспортируют в виде цепочки взаимосвязанных ограниченных мембраной образований, которые в конце концов выгружают путем экзоцитоза. Эти вещества в основном состоят из белков или углеводов, часто соединенных в виде гликопротеинов или протеогликанов. Они составляют весьма обширный каталог.