Внутренняя мембрана митохондрий не-проницаема для протонов: сквозь нее не могут проникнуть ионы водорода. А значит, она непроницаема и для гидроксильных ионов, ОН~, которые в противном случае могли бы выступать в качестве носителей ионов Н+, забирая их с собой в виде Н2О и возвращая в виде ОН-. На самом же деле мембрана полностью непроницаема для ионов: ни один ион, будь он отрицательно или положительно заряжен, не может проникнуть сквозь нее в ощутимых количествах путем пассивной диффузии. Все распределение ионов между митохондриями и окружающим цитозолем четко регулируется с помощью специальных во-рот или насосов.
Имеется такой насос, вернее, два типа насосов, и для протонов. Оба предназначены для того, чтобы насильственно перекачивать протоны из митохондрий при условии снабжения энергией. Оба они обратимы, иными словами, могут вырабатывать энергию за счет внутреннего потока протонов. Но их энергетическое снабжение различно: один насос работает за счет электронов, другой — за счет АТФ. Короче говоря, секрет окфоса заключается в том, что поток электронов и синтез АТФ связаны между собой протондвижущей силой.Рассмотрим сначала насос, работающий за счет АТФ. При расщеплении одной молекулы АТФ на АДФ и неорганический фосфат насос выводит п протонов из тела митохондрии. Он может продолжать работать таким образом до тех пор, пока способен превосходить потенциал протонов образующийся снаружи. Когда же этот потенциал становится равным мощности насоса, последний перестает работать, точно так же, как это происходит с электрическим насосом, который способен накачивать воду только на определенный уровень в зависимости от мощности электродвигателя. Мощность насоса, работающего под действием’ АТФ, нам известна: она составляет примерно 14 ккал/г-моль расщепляющейся молекулы АТФ. Поэтому максимальный уровень, на который он может поднять протоны, равен приблизительно 14/я ккал/протон-эквивалент.
По такому же принципу работает и электрон-управляемый насос, если не считать того, что он снабжается энергией, высвобождаемой парой электронов, падающих вниз через разность потенциалов. Если эта разность составляет 300 мВ, то получаемая энергия будет равняться 14 ккал/пара электрон-эквивалент. Такой насос, как и АТФ-управляемый насос, перестанет работать, когда потенциал протонов достигнет 14/п ккал/протон-эквивалент, где п — количество протонов, которое насос перемещает на каждую пару падающих электронов. Оказывается, что значение п для двух типов насосов одинаково; в противном случае сопряженная система, описанная здесь, не смогла бы работать.
Если теперь нам известно, что два насоса работают совместно против одного и того же потенциала протонов и один из них оказывается чуть сильнее другого, то более мощный насос поднимет потенциал протонов выше предельного уровня более слабого насоса, который, если он обратим, начнет работать в обратном направлении. То же происходит с двумя электрическими насосами, перекачивающими воду вверх в один и тот же резервуар: если один из них сильнее, он поднимет воду на уровень, достаточный для того, чтобы направить поток обратно через более слабый насос и заставить его работать в качестве генератора. В обратимой системе такого типа количество электричества, вырабатываемого вторым насосом, будет равно количеству электричества, потребляемого первым насосом, за исключением ничтожно малых потерь из-за несовершенства системы. Таким образом электрическая энергия передается с помощью гидравлического преобразователя.Аналогичная ситуация наблюдается в митохондриальной мембране, только уже с другими видами насосов и энергии. Чаще всего более мощным из двух митохондриальных насосов оказывается тот, который приводится в действие электронами, ибо он все время снабжается топливом в процессе метаболизма, тогда как АТФ постоянно потребляется для выполнения различных видов работы в клетке. Вот почему АТФ-управляемые насосы работают в обратном направлении, создавая АТФ с помощью протондвижущей силы, которая снабжается потоком электронов.
Обычно эта система не работает в обратном направлении, так как для этого не существует отдельного источника АТФ Но может случиться, что один из электрон управляемых насосов окажется более мощным, чем другие. Как мы помним, в дыхательной цепи имеются три окфос-блока, каждый из которых связан с разными носителями электронов, а следовательно, с разными насосами протонов. Самый мощный из них тот, что находится на участке III. Его разность потенциалов близка к 500 мВ, поэтому он в основном необратим, тогда как насосы на участках I и II легко обратимы; их разность потенциалов около 300 мВ. Благодаря дополнительному падению до участка III электроны, поступающие в систему на уровнях с или Ь — Пытаясь представить себе эту систему, вы должны понять, что митохондриальные протонные насосы не секретируют просто кислоту, как это делает, например, протонный насос слизистой, выстилающей желудок. Дело в том, что вытесняемые протоны не сопровождаются отрицательно заряженными ионами и не обмениваются на другие положительно заряженные ионы. Как только протоны выталкиваются наружу, нарушается электрический баланс за счет потери положительных зарядов внутри митохондрий, а по всей митохондриальной мембране образуется электрический потенциал, положительный снаружи. По мере увеличения потенциала становится все труднее выталкивать протоны наружу против этого потенциала — вспомним, что, согласно закону Кулона, одноименные заряды отталкиваются друг от друга. В конце концов насос не выдержит перегрузки и остановится, когда работа, необходимая для проталкивания дополнительного положительного заряда против электрического потенциала, сравняется с мощностью насоса. Другими словами, протонный потенциал в этой системе выражается в основном в виде разности электрического потенциала через мембрану. Существует небольшое различие в кислотности между внутренней и внешней частями митохондрий, но оно несущественно.
Мы можем рассчитать мембранный потенциал митохондрии, зная, что мошность насоса составляет 14/п ккал/протон эквивалент (58 600/п Дж/протон-эквивалент) или
58 600 96 500 х га ~ ‘ / •
По Митчеллу, п — 2; в таком случае потенциал мембраны равен 300 мВ. Но не все ученые разделяют точку зрения Митчелла. Некоторые утверждают, что п — 3 или 4; в этих случаях потенциал будет составлять 200 или 150 мВ соответственно. Другие считают, что величина мембранного потенциала еще ниже, и не потому, что они, не согласны со стехиометрией Митчелла, а потому, что, по их мнению, протонный потенциал частично проявляется в конформационных изменениях мембраны. К сожалению, у нас нет необходимого вольтметра, позволяющего решить этот вопрос. Да и зрение наше не настолько острое, чтобы можно было обнаружить, изменяются ли очертания и формы молекул при энергизации микросфер.Что же мы знаем о самих насосах? Увы, очень мало. Известно несколько АТФ-управляемых протонных насосов. Помните, один из них находится в мембране эндосом и лизосом? Что же касается молекулярного механизма, связывающего перенос протонов с гидролизом АТФ, то ни для одного из насосов он еще не открыт. Известно только, что митохондриальный АТФ-управляемый протонный насос находится в маленьких узелках, выступающих с внутренней стороны мембраны; их можно выборочно разрушить веществом, называемым олигомицином. Как указывает само название, олигомицин получают из плесени . В нашем путешествии мы встретимся и с другими «мицинами». Они являются поистине бесценными помощниками биохимиков и молекулярных биологов, помогая им расшифровать некоторые наиболее сложные биологические механизмы. Интересно, что все эти вещества в некотором роде представляют собой ответвления от пенициллина. До открытия последнего немногие ученые проявляли интерес к плесени. Но после того, как стало известно, что плесневый грибок производит вещество (вполне понятно названное пенициллином), способное остановить развитие некоторых патогенных микробов, начался широкий поиск других плесневых продуктов, обладающих свойствами антибиотиков. С этой целью по всему миру отбирали сотни тысяч линий плесени и получали большой «урожай» активных веществ. Некоторые из них, например стрептомицин, были использованы в клинике. Но от большинства других пришлось отказаться, так как они оказались крайне токсичными для организма человека. Эти вещества подавляют ряд важных биологических процессов, в частности транскрипцию ДНК, синтез белка или окислительное фосфорилирование. В биохимии нередко о работе какого-либо механизма можно судить по тому, как он блокируется ингибиторами. Вот почему эти вещества, будучи непригодными для лечения людей, оказались бесценными для науки. Этот факт, как, впрочем, многие другие в истории науки, лишний раз свидетельствует о том, сколь непредсказуемы открытия и сколь недальновидны те бюрократы, к сожалению, все чаще встречающиеся в последнее время, которые ограничивают деятельность ученых строго определенными программами.
Возвращаясь к электрон-управляемым протонным насосам, мы должны уяснить для себя их место в молекулярной архитектуре самих микросфер, поскольку их работа зависит от обязательного сопряжения между переносом электронов и выведением протонов. Митчелл высказал простую, но любопытную гипотезу относительно такого сопряжения: он предположил, что электроны поступают в окфос — блоки в в1 ае атомов водорода, поставляемых из митохондрий, а покидают окфос — блоки «обнаженными», сбросив протоны снаружи. Согласно модели Митчелла, микросферы образованы из перемежающихся водород — и электроннесущих сегментов, которые образуют петли в толще мембраны. Если это действительно так, вопрос ясен. Но, спрашивается, какого рода ограничения должна налагать молекулярная анатомия микросфер на поток электронов? Ограничение заключается в том, что электроны проталкиваются по синусоидальному пути, который ведет их попеременно от одной стороны мембраны к другой, причем в одном направлении вместе с протонами, а в другом — без них. На самом деле, механизм гораздо сложнее, чем следует из нашего упрощенного описания; он вклю-чает в себя тонкие физико-химические и конформационные изменения, связанные с прохождением носителей от окисленного состояния к восстановленному. Добавьте все эти требования к перечисленным выше, и перед вами будет весьма сложный, четко работающий механизм. Не забывай-те, что весь он умещается в крошечной «биочастице» толщиной в 0,3-миллионную и шириной в одну миллионную часть дюйма!
Из-за внутренних структурных ограничений митохондриальные окфос-блоки не расходуют энергию зря. Поток электронов и синтез АТФ по необходимости сопряжены; это означает, что скорость потока электронов (а также субстрата и потребления кислорода) автоматически доводится до скорости потребления АТФ. В состоянии покоя используется мало АТФ и, следовательно, потребление пищи и дыхание находятся на низком уровне. Но как только появляется внезапная потребность в АТФ, например у спортсмена, начинающего забег, электронный поток тут же многократно увеличивается, вызывая одновременно пропорциональное увеличение катаболического окисления и потребления кислорода. Этот регуляторный механизм называется дыхательным контролем.
Дыхательный контроль зависит от силы связывания, которая в свою очередь определяется непроницаемостью мембраны для протонов. Любое вещество, способное транспортировать протоны через липидный бислой мембраны (протонный ионофор), тут же вызовет разрушение протонного потенциала и, таким образом, приведет к раскрытию системы. Известны многие такие разъединяющие вещества. Их прототипом служит 2,4-динитрофенол.
Другим способом снятия заряда с мембранного потенциала является внесение в систему положительно заряженного иона, способного проникать через мембрану в митохондрии. Но, для того чтобы это произошло, в мембране должен быть подходящий носитель. В природе существует носитель для ионов кальция, поэтому митохондрии стремятся предохранить свое окружение от ионов кальция. Это важный регуляторный механизм (см. гл. 12). Путь для поступления ионов калия можно создать искусственно, внося валиномицин, плесневый токсин, обладающий свойствами ионофора калия. Заметим, что при этом работа все же производится. Электронный поток поддерживает активный транспорт добавленного катиона внутрь митохондрий в обмен на транспорт протонов наружу.
В заключение необходимо указать, что окфос-блоки субстратного уровня, например такие, какие имеются при гликолизе или в цикле Кребса, работают не за счет протондвижущей силы. Они относятся к чисто химическим преобразователям. Длительное время ученые представляли механизм фосфорилирования на субстратном уровне как связанное с мембраной фосфорилирование на уровне медиаторов, которое имеется в митохондриях, ибо большинство из них искали несуществующие химические посредники.
